Ученые нашли белок для "выключения" генов на уровне РНК

Москва. 23 мая. INTERFAX.RU - Международная группа ученых из России и США обнаружила фермент, который способен специфически уничтожать нужную РНК с помощью РНК-гида. Нуклеаза входит в одну из разновидностей системы CRISPR, однако, в отличие от широко известных CRISPR/Cas9, действует на уровне РНК, а не ДНК, что избавляет весь метод от риска дестабилизации генома из-за внесения "неправильных" разрывов, сообщает сайт N+1. Работа пока не прошла рецензирование и доступна в виде препринта в базе bioarXiv.org.

Созданная в 2012 году система редактирования генома CRISPR/Cas9 основана на системе бактериального противовирусного иммунитета. Такой иммунитет позволяет бактериям находить фрагменты ДНК вируса в своей "картотеке" CRISPR (она расположена в определенном участке генома бактерии) и уничтожать вирусную ДНК с помощью специальной нуклеазы.

У разных бактерий и архей существует несколько типов системы CRISPR и несколько нуклеаз, однако для целей редактирования генома в биоинженерии почти всегда используется нуклеаза Cas9 (это отражено в названии метода). Главное преимущество именно этой нуклеазы в том, что Cas9 работает самостоятельно (это один белок), в то время как большинство остальных нуклеаз CRISPR работают в комплексе из нескольких ферментов, а использовать мультисубъединичные комплексы для редактирования генома неудобно и часто неэффективно.

Минусы Cas9

У системы CRISPR/Cas9 есть три ключевых недостатка. Во-первых, нуклеаза Cas9 — довольно большой белок, ген которого часто не "влезает" в те носители (векторы), что используются для введения генетических конструкций в клетках.

Во-вторых, Cas9 действует только на ДНК, а не РНК. Это нельзя назвать недостатком если мы действительно хотим редактировать геном клетки, то есть менять ее ДНК. Однако часто нужного результата можно добиться просто "выключив" активность нужного гена на уровне РНК — просто уничтожив все сделанные с этого гена копии. Такое вмешательство, известное по примеру РНК интерференции, потенциально более безопасно, так как не вносит нестабильности в геном. Например, если даже нуклеаза ошибается в выборе мишени, это никак не ведет к появлению мутаций в геноме. Такой метод потенциально может быть ближе к терапевтическому применению, чем настоящее редактирование генома с помощью CRISPR/Cas9.

В-третьих, сейчас метод редактирования генома CRISPR/Cas9 является предметом патентного спора, что может существенно отложить его приход в клиническую практику. Все эти причины требуют поиска новых нуклеаз, которые можно было бы использовать для регуляции активности генов.

В поисках нуклеазы

Ранее этой же группе исследователей удалось создать биоинформатическую систему поиска новых видов иммунитета CRISPR в геномных данных бактерий и найти новый класс систем CRISPR, том числе гипотетическую нуклеазу С2с2. Это небольшой белок, который, как показывал анализ последовательности, скорее всего действует не на ДНК, а на РНК.

В новой работе ученым удалось подтвердить эти предположения и опробовать новую систему CRISPR/C2c2 в действии. Для этого авторы перенесли последовательности CRISPR, C2c2 и других компонентов системы из лептотрихии (Leptotrichia shahii), в геноме которой ее обнаружили, в геном кишечной палочки. Затем ученые заражали бактерию РНК-вирусом MS2 и смотрели на выжившие клетки. Таким образом удалось обнаружить фрагменты вируса, которые наиболее всего уязвимы для действия CRISPR/C2c2 и определить субстратные предпочтения фермента C2c2.

В качестве теста биоинженерных свойств системы CRISPR/C2c2 авторы научились выключать красное свечение бактерий за счет уничтожения РНК предварительно введенного в клетки гена красного флюоресцентного белка. По словам ученых, эффективность выключения составила от 20 до 92 процентов, в зависимости от выбранной мишени на РНК флюоресцентного белка.

Такая эффективность сравнима с эффективностью РНК-интерференции, которая работает сходным образом, но за счет других молекулярно-биологических механизмов. У РНК-интерференции при этом есть собственные недостатки. Например, короткие РНК, которые вводятся в клетки для выключения генов, очень быстро уничтожаются неспецифичными РНКазами и часто не могут проникнуть в клетку, из-за чего терапевтическая эффективность существенно снижается.